В 1019 году великим князем киевским становится Ярослав — сын князя Владимира и полоцкой княжны Рогнеды. В годы его правления Киевское княжество достигло своего наивысшего расцвета: он разгромил печенегов, небезуспешно совершал походы в Прибалтику, основал ряд городов — Юрьев, Ярославль, Суздаль и другие. 

Князь Ярослав правил долго и счастливо, крепко держал бразды правления в своих руках, цвела при нем Русская земля, и прозвали его на Руси и в других государствах Мудрым. При нем началось летописание, открываются библиотеки и школы, переводятся на славянский язык иностранные книги. При Ярославе и его сыновьях был составлен первый общерусский свод законов «Русская Правда», князь покровительствовал торговле, ремеслам и каменному строительству.
Новые храмы поставил князь Ярослав в Киеве, а главную церковь земли Русской возвели на том месте, где, по преданию, в 1037 году были разбиты печенеги. 

Ярослав Мудрый вызвал из Греции мастеров и художников, которые украшали собор, и древняя живопись, написанная на стенах храма, сохранилась до сих пор. 

Например, в верхней части главного алтаря изображен кроткий лик Пресвятой Богородицы, исполненный смиренномудрия. Руки Ее воздеты к небу в непрестанной молитве за этот край. Митрополит Иларион, русский церковный деятель, писал: «Церковь дивна и славна всем окружающим странам, яко же она не обрящется во всем полунощи земном от Востока до Запада».
Новый собор князь Ярослав Мудрый посвятил Софии — «божественному разуму и мудрости, которые правят миром». Построенный как главный митрополичий собор Руси, он служил и великокняжеской усыпальницей. Здесь покоится прах и самого Ярослава Мудрого, умершего в 1054 году и перед смертью принявшего постриг с именем Георгий. Гробница его, сохранившаяся до настоящего времени, представляет собой массивный саркофаг весом 6 тонн и высотой— 1,81 метра. Сначала он находился в западной части храма, откуда его перенесли и в XII веке установили слева от главного алтаря храма — в северном Владимирском приделе.
Нижняя часть саркофага представляет собой прямоугольный ящик, высеченный из цельной глыбы мрамора; верхнюю крышку украшает остроконечное завершие, выполненное по типу двухскатной кровли. Саркофаг украшен резными изображениями христианских символов — крестов, деревьев, рыб и птиц. На гробнице сделаны две греческие надписи: «Свет Христов просвещает всех» и «Иисус Христос Победитель».
В летописях не указывается точное место погребения князя Ярослава Мудрого в соборе Святой Софии, поэтому долгое время не было уверенности в истинной принадлежности этого саркофага именно ему. Саркофаг вскрывали и исследовали два раза — в 1936 и 1939 годах. Ученые обнаружили в нем мужской и женский скелеты, кости которых оказались перемешанными. Киев и Софийский собор не раз становились добычей завоевателей, которые грабили и захоронения. Поэтому никаких драгоценностей, даже остатков одежды и тканей, кроме клочка выцветшего шелка, на скелетах и в саркофаге найдено не было.
Из летописей известно, что князь Ярослав с детства немного прихрамывал, а излечился от своей немощи, по словам летописей, внезапно, когда мать его получила от князя Владимира сообщение о разводе.

Позже он получил серьезное ранение в бедро, и антропологи обнаружили патологическое изменение кости правой ноги мужского скелета, что и позволило установить его принадлежность именно Ярославу Мудрому. Скульптор-антрополог М.М. Герасимов по черепу создал скульптурную версию облика великого князя, это изображение и сегодня находится в Софийском соборе Киева.
Рядом с Ярославом Мудрым покоится прах его сына — великого киевского князя Всеволода, умершего 13 апреля 1093 года. 

Он активно боролся с половцами и нанес им ряд сокрушительных поражений, был одним из образованнейших людей своего времени, знал 5 иностранных языков, основал в Киеве Андреевский монастырь.
В 1099 году в Софийском соборе был похоронен сын князя Всеволода — Ростислав, утонувший в Стугне, когда киевская рать, разбитая половцами, переправлялась через реку. Тело князя Ростислава перенесли в Киев, и «плакася по нем мати его и все люди плакаша по нем поелику… и собрашася епископы и Попове, и черноризцы, и песни обычные певше, и положили в церкви св. Софии, у отца своего».
В 1126 году умер и был погребен в Софийском соборе другой сын князя Всеволода — Владимир Мономах. Он покровительствовал ремеслам, торговле и искусствам, тоже знал несколько языков, любил чтение и сам имел литературный дар.

 При нем была составлена вторая редакция летописи «Повесть временных лет». В 1154 году в Софийском соборе был похоронен и сын Владимира Мономаха — Вячеслав.
Кроме перечисленных князей, в Софийском соборе погребены и другие представители княжеского рода, но из всех захоронений великокняжеской усыпальницы идентифицирован и сохранился, как указывалось выше, только саркофаг Ярослава Мудрого.
В XIX веке в Михайловском приделе собора был найден пустой саркофаг, без крышки и по размерам уступающий саркофагу Ярослава Мудрого. 

Некоторые ученые предположили, что в нем мог быть погребен сам Владимир Мономах или кто-то из его сыновей.
К святыням Софийского собора относятся и мощи митрополита Киевского Макария — священномученика и чудотворца. Он родился в Литве, в юности принял монашество и уже скоро прославился своей благочестивой жизнью. В 1495 году святой Макарий был избран киевским митрополитом, а через два года, когда он объезжал свою епархию, в деревне Стригалове (близ Припяти) его настигли крымские татары. 

Они отрубили святителю голову и кисть правой руки, которые и отсутствуют при святых мощах его, привезенных в Киев и в настоящее время почивающих открыто. Память святителя Макария празднуется 1 мая, и тогда святые мощи его после ранней обедни с молебными песнопениями обносятся вокруг Софийского храма.
Под внутренними сводами собора погребены тела и других киевских митрополитов, в частности известного святостью своей жизни Рафаила Заборовского и просветителя Самуила Миславского.
Много в Софийском соборе и других святынь, а в особой серебряной гробнице, стоящей на возвышении в северной части храма, находятся капля крови Господней, частица ризы Спасителя и частица Животворящего креста Господня.

 В храме хранятся также частицы мощей Святого Иоанна Крестителя, апостолов Матфея и Петра, великомученика Георгия и других святых мужей.